El antiséptico para pezones Cow Guard® fue evaluado de acuerdo con el método de los pezones escindidos (Protocolo A del National Mastitis Council, EE.UU., 1982), utilizando la metodología siguiente: (a) aplicación de una suspensión en leche de cepas de referencia de Staphylococcus aureus (ATCC 29740) y de Escherichia coli (ATCC 35218) en concentración conocida, en pezones de vaca escindidos (n=10 para cada repetición); (b) desinfección de los pezones con el antiséptico evaluado con un tiempo de exposición de 10 minutos; (c) como controles se utilizaron 10 pezones sobre los cuales no se aplicó antiséptico; (d) enjuague estandarizado con solución inactivante y recuento del número de unidades formadoras de colonias (UFC) de organismos recuperados a partir de los pezones tratados con el antiséptico a evaluar y los controles por medio de cultivo bacteriano. .

Para el enjuague de los pezones tratados con COW GUARD, así como para el control positivo a base de peróxido de hidrógeno empleado en el ensayo 2 se utilizó un inactivante a base de lecitina, Tween 80 y lauril sulfato de sodio; mientras que para el enjuague de los pezones tratados con antiséptico a base de iodo, se utilizó tiosulfato de sodio al 1%. Para S. aureus se utilizó como medio de prueba agar manitol salado (Britania), mientras que para E. coli se utilizó medio McConkey (Britania). Como control positivo fue utilizado un antiséptico para pezones comercial de primera marca con una concentración de 10.000 ppm de iodo disponible y un antiséptico comercial a base de peróxido de hidrógeno (0,5%). Las UFC presentes en las placas se contaron luego de un período de incubación de 24 hs a 37°C. El recuento por pezón se obtuvo a partir de la media geométrica del recuento de las placas, multiplicado por el factor de dilución y por 50 (volumen total de líquido recuperado). En los casos en los cuales no se recuperaron organismos a partir de los pezones tratados, se utilizó el valor 0,01 en lugar de cero (0), ya que la media geométrica para cero no está definida.